Spectrométrie de masse

Un article de Wikivisual, l'encyclopédie libre.

La spectrométrie de masse est une technique d'analyse qualitative et quantitative. Elle permet l’identification de molécules d’intérêt d'un échantillon, en en analysant les différents constituants après ionisation et parfois fragmentation dans un spectromètre de masse. Cette technique utilise les champs électriques et magnétiques afin de séparer les ions obtenus en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).

Sommaire

1 Structure d'un spectromètre de masse
2 A quoi sert la spectrométrie de masse ?
3 La source d'ionisation
- 3.1 L'electrospray
- 3.2 L'APCI
4 L'analyseur
5 La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)
- 5.1 Le triple quadripole
- 5.2 <math>MS^n</math> en trappe d'ions
6 Voir aussi
7 Liens externes

[modifier] Structure d'un spectromètre de masse

Image:Spectrographe de Masse.png

Le spectromètre de masse, initialement conçu par le britannique Joseph John Thomson, comporte une cellule d'ionisation suivie d'un filtre soit par temps de vol, soit par trajectoire, et finalement d'un détecteur permettant de compter chaque ion et de faire ainsi le spectre des masses des ions issus des molécules de l'échantillon à analyser.

Le spectromètre de masse se compose donc de quatre parties :

Le système d’introduction de l’échantillon : c’est souvent un dispositif de séparation (chromatographie en phase liquide, chromatographie en phase gazeuse, électrophorèse capillaire , ...), à moins que l’échantillon ne soit introduit en tant que tel dans la source, sous forme liquide (injection, infusion continue) ou solide (canne d’introduction directe pour désorption, dépôt sur plaque MALDI, ...).

La source : où les substances d’intérêt passent en phase gazeuse, puis sont transformées en ions positifs ou négatifs suivant le mode choisi. Il existe plusieurs méthodes d'ionisation, chacune ayant des contextes d'applications propres.

Utilisé pour répondre à des questions d'ordre chimique :

L'impact électronique (EI)
L'ionisation chimique (CI)
L'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)

Utilisé aussi beaucoup en biologie, notamment en protéomique :

L'ionisation par électrospray (ESI)
La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)
La désorption-ionisation laser activée par une surface (SELDI)

L’analyseur : où les ions sont triés en fonction de leur rapport masse (m) / charge (z) par l’application d’un champ magnétique et/ou électrique. Sont utilisés : la trappe à ions (IT), le temps de vol (TOF), le quadripôle (Q), les trappes d'ions linéaires (LIT, pour Linear Ion Traps), la résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR), le secteur magnétique et/ou électrique, l'orbitrap.
Le détecteur et l’enregistreur : le détecteur collectera les ions en fonction de leur rapport m / z. L’enregistreur convertira les informations en spectre de masse.

[modifier] A quoi sert la spectrométrie de masse ?

Identification : Suivant la molécule et surtout le type d'ionisation, le spectre de masse peut être caractéristique d'une molécule. Ainsi en comparant les spectres obtenus avec des spectres références ou des banques de spectres théoriques, on peut déterminer la nature de la molécule recherchée (analyse de petites molécules en EI, carte peptidique massique pour l’analyse de protéines en MALDI).
Informations basiques sur la molécule à analyser :
- La masse moléculaire. La parité de celle-ci donne en outre la parité du nombre d’atomes d’azote qu’elle contient (règle de l’azote). Si la masse moléculaire est déterminée par un analyseur suffisamment précis (TOF, secteur magnétique, FTICR), elle peut permettre de déduire la formule brute de la molécule.
- La présence de Chlore, Brome, et autres éléments qui présentent un profil isotopique caractéristique
Analyse structurale grâce à la fragmentation (en ionisation EI, ESI, APCI, et plus généralement par la spectrométrie de masse en tandem)
Quantification

[modifier] La source d'ionisation

Deux sources à pression atmosphérique, dites à "ionisation douce", sont principalement utilisées en couplage avec la chromatographie en phase liquide.: l'electrospray et l'APCI.

[modifier] L'electrospray

Son principe est le suivant : les gouttelettes de solutés sont formées à l'extrémité d'un fin capillaire de silice, métallisé en surface et porté à un potentiel élevé. Le champ électrique intense leur confère une densité de charge importante. Sous l'effet de ce champ et grâce à l'assistance éventuelle d'un courant d'azote co-axial, l'effluent liquide est transformé en nuage de fines gouttelettes (spray) chargées suivant le mode d'ionisation. Sous l'effet d'un second courant d'azote chauffé, les gouttelettes s'évaporent progressivement en perdant des molécules de solvant par des mécanismes complexes de désolvatation et d'évaporation. Leur densité de charge devenant trop importante, les répulsions électriques atteignant le niveau des tensions superficielles, les gouttelettes explosent en libérant des microgouttelettes constituées de molécules protonées ou cationisées de l'analyte, porteuses d'un nombre de charges variable. Les ions ainsi formés sont ensuite guidés à l'aide de potentiels électriques appliqués sur deux cônes d'échantillonnage successifs. Durant ce parcours à pression élevée, les ions subissent de multiples collisions avec les molécules de gaz et de solvant, ce qui complète leur désolvatation. En modulant le premier potentiel de cône, il est possible de faire varier l'énergie des collisions et provoquer ainsi une fragmentation plus ou moins importante des ions dans la source. L'avantage de cette méthode d'ionisation comme pour l'APCI est l'obtention d'ions multichargés, pour les macromolécules, polymères, etc...

[modifier] L'APCI

Les échantillons liquides sont directement introduits dans un nébuliseur pneumatique. Sous l'effet d'un jet d'air ou d'azote, le liquide est transformé en fin brouillard. Un chauffage assure ensuite la désolvatation des composés. Ces derniers sont ensuite ionisés chimiquement à pression atmosphérique : en général, la phase mobile vaporisée joue le rôle de gaz d'ionisation et les électrons sont obtenus à partir de décharges d'électrode couronne. L'ionisation des composés est très favorisée lors de ces techniques car la fréquence des collisions est élevée à pression atmosphérique. L'APCi est une technique analogue à l'ionisation chimique, elle fait appel à des réactions ions molécules en phase gazeuse à pression atmosphérique et conduit essentiellement à la formation d'ions [MH]+ ou [M-H]-.

[modifier] L'analyseur

[modifier] L'analyseur quadripolaire

Un quadripole est constitué de quatre électrodes parallèles de section hyperbolique ou cylindrique. Les électrodes opposées distantes de 2<math>r_0</math> sont reliées entre elles et soumises au même potentiel. Les électrodes adjacentes sont portées à des potentiels de même valeur, mais opposés de sorte que l'écart de potentiel soit égal à <math>\phi_0</math> (Figure à venir). Ce potentiel <math>\phi_0</math> résulte de la combinaison de tensions l'une continue (U) l'autre alternative (V) de fréquence f : <math>\phi_0 = U - V\cdot cos (2\pi ft)</math> En appliquant cette différence de potentiel entre chaque paire d'électrodes il se crée un champ électrique quadripolaire. Un point de coordonnées (x,y,z) situé dans le champ électrique sera alors soumis au potentiel : <math>\phi = \phi_0 \cdot \frac {x^2 - y^2}{r_0^2} </math> La trajectoire d'un ion pénétrant dans le quadripôle sera donc uniforme selon l'axe z et décrite par les équations de Mathieu selon les deux autres axes. Il est possible de définir en fonction des valeurs U et V des zones de stabilité telles que les coordonnées x et y de l'ion restent strictement inférieures à <math>r_0</math>. L'une d'entre elles est exploitée en spectrométrie de masse (Figure à venir) (Les ions qui se trouvent dans cette zone auront donc une trajectoire stable dans le quadripole et seront détectés). En gardant constant le rapport U/V, on obtient une droite de fonctionnement de l'analyseur. Un balayage de U/V permet l'observation successive de tous les ions dont la zone de stabilité est coupée par la droite de fonctionnement. La résolution entre ces ions est d'autant plus grande que la pente de la droite est élevée. En l'absence de tension continue, tous les ions de rapports m/z supérieurs à celui fixé par la valeur de V appliquée auront une trajectoire stable (x et y < <math>r_0</math>), le quadripôle est alors dit transparent et sert de focalisateur d'ions. Les principaux avantages du spectromètre quadripolaire résident dans sa souplesse d'utilisation, sa résolution unitaire sur toute sa gamme de masse, sa vitesse de balayage élevée ainsi que son adaptabilité à différentes interfaces permettant le couplage avec la chromatographie gazeuse ou liquide.

[modifier] La trappe ionique

C'est un filtre de masse où la préparation, l'analyse et la détection des ions s'effectuent dans un même espace, suivant des séquences temporelles successives. La trappe est constituée de trois électrodes à section hyperbolique : une électrode annulaire encadrée par deux électrodes (d'entrée et de sortie) qui forment les calottes supérieure et inférieure du dispositif. Une tension en radiofréquence <math>V\cdot cos (2\pi ft)</math> combinée ou non à une tension continue U est appliquée entre l'électrode centrale et les deux électrodes calottes. Le champ résultant est alors tridimensionnel. Les domaines de stabilité des ions sont à nouveau déterminés par les équations de Mathieu. Celui exploité est défini tel que lorsque les ions en sortent, leur trajectoire radiale reste stable contrairement à celle selon l'axe des z. Un balayage de l'amplitude de la radiofréquence V entraînera donc l'expulsion des ions piégés selon cet axe, vers le détecteur. Les trajectoires stables des ions, au sein du champ quadripolaire résultant sont tridimensionnelles, en forme de huit.

[modifier] Le temps de vol

[modifier] Principe

L'analyseur à temps de vol consiste à mesurer le temps que met un ion, soumis à une tension préalable, à parcourir une distance donnée.

En effet, l'énergie cinétique vaut :

<math>E_c = \frac{1}{2} \cdot m \cdot v^2 = \frac{1}{2} \cdot m \cdot \frac{l^2}{t^2}</math> m étant la masse, v la vitesse, l la distance parcourue et t le temps de vol.
Par ailleurs, un ion de charge z soumis à une tension accélératrice V gagne une énergie cinétique

e étant la charge élémentaire et q étant l'état d'ionisation de la particule.

On en déduit ainsi <math>\frac{m}{q} = 2 \cdot e \cdot V \cdot \frac{t^2}{l^2}</math>

Le rapport masse sur charge est directement mesurable à partir du temps de vol.

[modifier] Fonctionnement

Un analyseur à temps de vol se compose d'une zone d'accélération où est appliquée la tension accélératrice, et d'une zone appelée tube de vol, libre de champ. Les ions accélérés pénètrent dans le tube de vol libre de tout champ. La séparation des ions ne va donc dépendre que de la vitesse acquise lors de la phase d'accélération. Les ions de rapport m/z le plus petit parviendront au détecteur les premiers. Pour chaque groupe d'ions de même rapport m/z, un signal est enregistré au niveau du détecteur sous la forme d'une fonction temps/intensité. Ce mode de détection comporte cependant certaines limitations en terme de résolution : ainsi deux ions identiques, de même vitesse initiale, mais localisés à deux points différents, entreront dans le tube de vol à des vitesses et des temps différents. Celui le plus loin du détecteur à l'origine sera accéléré plus longtemps et aura donc un temps de vol plus court, d'où une dispersion en temps et en énergie. Le mode réflectron permet de pallier ce phénomène.

En mode réflectron, un miroir électrostatique impose un champ électrique de direction opposée à celle du champ accélérateur initial, et donc du mouvement des ions. Ces derniers voient ainsi leur trajectoire modifiée : ils pénètrent dans le réflectron et en ressortent avec une vitesse longitudinale de sens opposé à leur vitesse initiale. Les ions les plus énergétiques arrivent les premiers au niveau du réflectron et vont y pénétrer plus profondément, ils seront donc réfléchis dans un temps plus long. De cette façon, tous les ions de même rapport m/z se trouvent focalisés sur un même plan, le détecteur du réflectron étant placé sur le plan de focalisation de ces ions. En outre, le réflectron permet d'allonger la distance de vol sans pour autant augmenter la taille de l'analyseur : les ions mettent plus de temps pour atteindre le détecteur, et réduisent aussi leur dispersion en temps, la résolution s'en trouve donc grandement améliorée.

[modifier] L'analyseur à secteur magnétique

L'ion est éjecté dans un milieu dans lequel règne un champ magnétique uniforme perpendiculaire au plan de la trajectoire. Du fait de la force de Lorentz, la trajectoire se courbe, et le point d'impact de l'ion (donc sa déviation) permet de connaître sa masse à partir de la charge.

En effet, soit <math>\vec B\,</math> le champ magnétique (dirigeant <math>\overrightarrow{Oz}</math>) de coordonnées <math>\begin{pmatrix} 0 \\ 0 \\ B \end{pmatrix}</math> et <math>\vec v_0\,</math> la vitesse initiale orthogonale à <math>\vec B\,</math>, elle dirige <math>\overrightarrow{Ox}</math>.

On a alors: <math>q \vec v \wedge \vec B = \begin{pmatrix} qB\dot y \\ -qB \dot x \\ 0 \end{pmatrix}</math>.

D'où, en écrivant la relation fondamentale de la dynamique : <math>\left\{\begin{matrix} m \ddot x =qB \dot y \\ m \ddot y = -qB \dot x \end{matrix}\right.</math>.

Soit: <math>\left\{\begin{matrix} \ddot x -\omega_0\dot y =0 \\ \ddot y + \omega_0\dot x=0 \end{matrix}\right.</math> où <math>\omega_0=\frac{qB}{m}</math>.

Posons <math>\tilde V=\dot x + i\dot y</math>.

On a alors <math>\dot \tilde V + i\omega_0\tilde V=0</math>.

En résolvant, <math>\tilde V(t) =v_0 e^{-i\omega_0t}=v_0cos(\omega_0t) - v_0isin(\omega_0t) </math>.

Et donc: <math>\left\{\begin{matrix} \dot x(t) =v_0cos(\omega_0t) \\ \dot y(t) =-v_0sin(\omega_0t)\end{matrix}\right.</math> <math>\left\{\begin{matrix} x(t) =\frac{v_0}{\omega_0}sin(\omega_0t) \\ y(t) =\frac{v_0}{\omega_0}cos(\omega_0t) -\frac{mv_0}{qB}\end{matrix}\right.

</math> (à l'aide des conditions initiales).

Il s'agit bien de l'équation paramétrique d'un cercle de rayon <math>R_c=\frac{mv_0}{\left|qB\right|}</math>.

Le spectromètre mesure ensuite les distances d'impact lorsque la particule a effectué un demi-cercle. La distance au point d'origine correspond au diamètre donc au double du rayon donné par la dernière formule. La charge de la particule permet donc d'en déduire sa masse.

[modifier] La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

La spectrométrie de masse en tandem consiste à sélectionner un ion par une première spectrométrie de masse, à le fragmenter, puis à effectuer une deuxième spectrométrie de masse sur les fragments ainsi générés. Elle peut être réalisée à l'aide de nombreux appareils combinant des secteurs magnétiques, électriques, quadripolaires ou des temps de vol, mais également au sein d'un même analyseur dans le cas d'une trappe d'ions.

[modifier] Le triple quadripole

Un triple quadripole résulte de l'association de deux analyseurs quadripolaires en série, séparés par une cellule de collision souvent constituée d'un quadripôle plus court. Cette combinaison de quadripôles permet de travailler en MS simple ou en tandem. Pour réaliser une acquisition en MS, il suffit de n'appliquer qu'une tension alternative à l'un des analyseurs pour le rendre "transparent" comme la cellule de collision, celle-ci ne contenant alors pas de gaz. Lors d'une acquisition en MS/MS, la cellule de collision est remplie d'un gaz inerte (argon par exemple) sous une pression relativement élevée (<math>10^{-2}</math> torr). L'énergie cinétique de l'ion sélectionné est convertie lors de ses collisions successives en énergie interne. La dissociation de l'ion se réalisera lorsque son énergie interne sera devenue supérieure à l'énergie d'activation nécessaire à la fragmentation. Cette technique de dissociation activée par collision (CAD) peut être amplifiée en augmentant l'énergie cinétique des ions sélectionnées par application d'une différence de potentiel entre la source et la cellule de collision. L'analyse MS/MS peut être menée selon trois modes différents selon l'information recherchée : le mode descendant est le plus utilisé, il permet d'obtenir des informations structurales, les deux autres modes (ascendant et perte de neutre) sont d'un usage plus restreint et permettent de mettre en évidence des ions ayant des particularités communes.

en mode descendant, l'ion à étudier est sélectionné en focalisant le premier analyseur sur son rapport m/z. Les fragments formés dans la cellule de collision sont séparés par le deuxième analyseur et analysés. Le spectre obtenu présente à la fois l'ion précurseur (ou ion parent) et ses ions fragments (ou ions produits).
en mode ascendant, le premier analyseur balaie une gamme de masse tandis que le deuxième est focalisé sur un seul rapport m/z. Tous les ions générés en source et capables de donner un fragment de même rapport m/z seront donc ainsi détectés.
en mode perte de neutre, les deux analyseurs balaient une gamme de masse simultanément et avec un décalage de masse constant. Le spectre établi présentera alors tous les ions parents capables de se fragmenter en générant un neutre de masse égale au décalage imposé.

[modifier] <math>MS^n</math> en trappe d'ions

Au sein d'une trappe d'ions, l'analyse en tandem se réalise dans un premier temps par sélection d'ions dont la valeur m/z est choisie. Ces ions piégés dans la trappe vont ensuite se fragmenter par excitation à l'aide d'une tension RF (radiofréquence) correspondant à leur fréquence de résonance, et les ions produits formés sont à leur tour piégés dans la trappe. Une éjection sélective en masse des ions fils peut alors être réalisée en vue de leur analyse. L'obtention d'ions de générations supérieures est possible par simple renouvellement du processus (sélection d'un ion produit, fragmentation, sélection d'un ion produit de 2e génération, fragmentation, etc...). Cette séquence est appelée <math>MS^n</math>, n étant le nombre de générations d'ions. Ainsi la <math>MS^2</math> est la MS-MS et ainsi de suite...